Page 230 - Zbornik 2023
P. 230
Gorazd Urbanič, Maja Pavlin Urbanič
Slika 1. Območje raziskav rib in školjk na odseku porečja spodnja Sava z označenimi mesti vzorčenja okoljske DNA (eDNA).
enkratno uporabo. Za vsak vzorec smo 30 minut in hitrosti vodnega toka. Na vsakem vzorčnem
ali do popolne nasičenosti filtrirne kapsule (25-30 mestu smo izvedli dve ponovitvi filtracije vode,
minut) filtrirali vodo s pomočjo vampirskega vzor- kar pomeni, da smo delali v paralelkah. Vzorčenje
čevalnika. Količine prefiltrirane vode iz vsakega smo izvedli v paralelkah, ker so Pont in sodelavci
vzorčnega mesta so lahko različne, saj so odvisne (2018) ugotovili, da sta bili dve ponovitvi dovolj za
od časa filtriranja, posredno pa od motnosti vode, ugotovitev 96,9 % ribjih vrst v reki Rhone v Fran-
in znašajo 1 L vode /minuto filtriranja oziroma ciji.
so ocenjene na 30 L v dobrih razmerah. V večini Za pridobitev podatkov o prisotnosti DNA vodnih
primerov smo filtriranje izvajali 30 minut. Po za- organizmov na podlagi eDNA s pomočjo verižne
ključku filtriranja smo filtrirno kapsulo izpraznili reakcije s polimerazo (PCR) smo v laboratoriju
s filtriranjem zraka, kapsulo pa napolnili z 80 ml izvedli več korakov: ekstrahiranje DNA, pomno-
pufra CL1 (SPYGEN) in shranili pri sobni tempera- ževanje DNA (amplifikacija DNA) in sekvenciranje
turi do ekstrakcije. Način vzorčenja je bil prilago- izbranih območij (tarčnih genov) DNA. Ekstrahira-
jen razmeram na terenu, predvsem globini vode nja DNA so bila izvedena v sobi, namenjeni redki
ali degradirani DNA. DNA smo pomnožili z upora-
Slika 2. Vzorčenje okoljske DNA (eDNA) (foto: M. Pavlin Urbanič) bo para univerzalnih primerjev za ribe in školjke.
Nato smo izvedli sekvenciranje nove generacije z
zahtevano globino sekvenciranja 500.000 sekvenc
za ribe in 300.000 sekvenc za školjke (za vsak par
primerjev, Unio in Vene), po standardnih protoko-
lih (Prié in sod. 2021, Valentini in sod. 2016). Na
vsaki stopnji protokola so bile poleg vzorcev ana-
lizirane negativne kontrole, da bi preverili čistost
uporabljenega potrošnega materiala in odkrili
morebitno navzkrižno kontaminacijo med ravna-
njem. Najprej je bilo izvedeno ekstrahiranje, ki
mu je sledilo pomnoževanje DNA, z uporabo para
230
